文献解读 | 矿物油脱蜡在FFPE DNA提取中的应用实例
为了从FFPE样品中提取高质量DNA，人们已经做出了相当大的努力。一些研究人员已经成功地提取了储存了20-25年的FFPE 样本DNA，采用的方法是用二甲苯/乙醇进行脱蜡，并使用盐析或苯酚纯化提取DNA。另外，Shi等人提出，在0.1M NaOH溶液中，在更高的温度下加热FFPE样品，可以大大提高DNA提取效率。通过加热和改良的自动DNA提取系统，提取的最近储存的FFPE组织（2-4年），已成功扩增和测序了更大的DNA片段（高达1182 bp）。
FFPE DNA提取过程的首要步骤是脱蜡，脱蜡不彻底会影响后续的消化，因此此步骤很重要。传统的脱蜡剂是二甲苯，而二甲苯具有很强的毒性，且致癌，需要在通风橱中进行操作，使得其应用有局限性。针对此问题，这里介绍一篇英文文献，作者描述了一种新的、简单但有效的脱蜡方案，即矿物油脱蜡，并使用市售试剂盒进行提取，为后续的基因分型实验提供了高质量DNA。
具体实验细节如下：
使用140只恒河猴的FFPE样本（肾脏和肝脏，保存于1981至2005年），140个蜡块，每个蜡块切3-4片（5μm厚）用于基因组的提取。将300μl矿物油添加到含组织切片的1.5 ml离心管中，90°C孵育20分钟去除蜡。DNA提取使用DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen Ltd., West Sussex, UK)，提取中无需去除矿物油。提取的DNA通过跑琼脂糖胶确定质量，并用Nanodrop测定浓度。
为了确定提取的DNA是否适用于PCR分析，作者按照保存时间选择8个FFPE样本，此8个样本代表了所有的时间分布，分别为1982年、1985年、1987年、1990年、1992年、1998年、2001年和2005年。此外，作者基于从Ensembl数据库下载的基因序列，设计β-actin的一组引物（1个正向引物和5个反向引物），通过扩增，预期产生109至609bp大小的片段。PCR体系体积为15μl，包含约25 ng提取的DNA、0.2 U HotStarTaq DNA聚合酶（Qiagen，UK）、0.3μM每个引物、0.2μM dNTP混合物和1.5 mM MgCl2。具体的PCR程序为：95°C，15分钟激活HotStarTaq DNA聚合酶，45个循环PCR(变性45秒、退火45秒、延伸45秒)，最后在72°C下延伸10分钟。扩增产物如图1所示。
图1 5种PCR扩增片段
图1注释：1-8泳道分别代表1982, 1985, 1987, 1990, 1992, 1998, 2001和2005年包埋的样本。
PCR分析后，使用140个FFPE样本的DNA，进行基因分型，目的基因涉及与人类染色体7和10的两个区域的14个微卫星标记。使用primer3设计引物，以确保所有扩增子的长度约为100bp，从而可以成功扩增大多数样品。用荧光染料（6FAM、VIC、NED或PET）标记每个正向marker的5′端，用于多重基因分型。针对不同的微卫星标记调节MgCl2浓度（从1.5至2.5M）。使用ABI 3700 DNA分析仪（Applied Biosystems，Foster City，CA）分析标记的PCR扩增子。基因型由Genemapper v3.7（Applied Biosystems）软件分析给出。如表1所示，对于每种微卫星标记物，88–100%的样本的PCR和基因分型成功，14种标记物的平均成功率为97%。为了研究包埋年份的影响，作者计算了每个样本的所有标记物的PCR成功率，结果表明平均PCR成功率与存档年份显著相关。包埋存档不到10年的样本，PCR成功率为100%，此期间的样本包埋时间和PCR成功率有一定的相关性。而当将分析限制在1980-1995年时，并无显著的相关性，如表1所示。
表1 针对每种微卫星标记，FFPE样本成功扩增/基因分型的数目及比例情况
此文章是第一份使用矿物油作为脱蜡试剂的报告。矿物油和石蜡已经在PCR反应中使用了多年，并且已知它们都不影响PCR反应效率；此外，石蜡可以完全溶解在矿物油中。出于这些原因，作者假设矿物油可以有效地从FFPE样品中去除蜡，而不会影响DNA质量，可用于PCR和基因分型实验，并由此设计实验进行了验证。
与最常用的二甲苯/乙醇法相比，本文所述方法非常简单有效。使用14个微卫星标记测试的140个样本，最低成功率为88%，远高于一些文章的结果：样本存档20-25年，使用二甲苯/苯酚方法获得69%的成功率，使用商业试剂盒获得75%的成功率。作者的研究结果表明，如果不需要大片段DNA分子，此方法可用于长期储存的样本——在某些情况下超过25年。因为在固定和包埋过程中DNA会断裂，从FFPE标本中提取的DNA，通常只允许对相对较短的靶序列的PCR扩增，很少超过300bp。当前研究中的DNA提取结果与这一观察结果一致：大多数片段的长度约为200 bp。本文对β-actin分析结果，存档年份与PCR成功率之间的相关性分析表明，储存时间可能会显著影响DNA的完整性和PCR扩增。因此，从长期储存的FFPE组织中提取的DNA，可能不适合更长的DNA分子分析，如重测序研究。但是，从FFPE组织样本中分离的较短片段DNA，可能适用于大多数只需要短DNA分子的遗传分析（如单核苷酸多态性、微卫星和甲基化状态分析）。
此外，值得注意的是，DNA的完整性受固定方法的严重影响，如固定剂和固定过程。Ydidis及其同事最近发表了一种改良的锌基固定方法，此方法大大提高了从保存长达14个月的组织中回收的DNA的质量和数量。这表明，组织保存固定过程的改进，将有助于在未来提取FFPE样本的遗传物质。
综上，本文介绍的矿物油脱蜡新方法简单有效，与市售的DNA提取试剂盒相结合，即使存档长达27年，这种方法也可以显著提高FFPE样本的DNA提取效率。
原文链接如下：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2764035/
