DNA定量浓度不一致？Nanodrop和Qubit谁更靠谱？

这一幕，是否似曾相识？元凶，很可能就是那个您以为“确定无疑”的DNA浓度！

当您发现同一个样本在Nanodrop和Qubit上测出的浓度相差甚远时，请不要第一时间怀疑仪器坏了。这背后，是两种截然不同的检测原理在“说话”。

Nanodrop方法是无法区分DNA和RNA的，也无法区分单核苷酸、核酸链和其它可在260nm处产生吸收峰的杂质。对于低浓度的核酸，由于仪器检测会有一个阈值线，受限于仪器的限制，Nanodrop测定低浓度核酸浓度时，会有较大程度偏差。

图1：Qubit和紫外吸收法对DNA-RNA混合样品的测定

通过对比不同方法的原理、结果趋势，可明确：‌Qubit荧光染料法更适配“精准区分核酸类型+高灵敏度定量”场景，对于需要精确DNA量的关键性下游应用，Qubit是毋庸置疑的更可靠选择。

Qubit检测试剂盒大多厂家提供的试剂盒检测范围为10pg-100ng，当加样量超出这个范围时，虽然可以检测到荧光信号，但计算出来的样本浓度是不准确的，当样品DNA浓度超过测定范围上限时，染料明显出现不足情况。

凡知医学的FireQubit dsDNA高灵敏检测试剂盒（FG4101）在对一系列不同浓度的dsDNA样本进行检测时，能够精准测定样本浓度，检测结果稳定可靠，性能优异，可满足高灵敏定量分析的需求（如下图所示）。

图2：测试结果

针对9个经过标准品系列梯度稀释的不同浓度(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.0781、0ng/μL)的dsDNA样本用凡知医学提供的FireQubit dsDNA高灵敏检测试剂盒（FG4101）进行检测，结果如图所示：dsDNA 样本在0-100ng区间具有良好的线性关系，并且样本重复性较好。

RNA，ssDNA，有机物，蛋白质，盐离子等均会对dsDNA浓度测定造成干扰。比如Mg²⁺，dNTPs会造成荧光抑制。因此，dsDNA样本如果有高浓度杂质污染时，定量结果会存在较大偏差。

不过不必担心，凡知医学提供的FireQubit dsDNA高灵敏检测试剂盒（FG4101）对于DNA中常见的污染物，如高浓度醋酸铵、氯化镁、氯化钠等具有足够的耐受性（如下图所示）。

图3：污染物对dsDNA定量检测试剂盒的影响

如图所示：将凡知FireQubit dsDNA高灵敏检测试剂盒应用于存在高浓度污染物的样本中定量dsDNA，结果表现优异，抗污染能力强。

温度也是影响dsDNA定量的一个因素，当检测试剂温度较高时，样本和染料结合效率降低，荧光值随之会下降，造成定量结果偏低，反之亦然。因此我们在使用Qubit定量过程中，一定要等试剂恢复室温后再使用，且测量过程中，不要手握管子避光导致检测管内试剂温度发生变化；当室内温度发生剧烈波动时，需要重新校正仪器。

耗材对精确定量也有较大的影响。如0.5ml Qubit检测管的透光度，批间稳定性等会对低浓度（0ng-1ng）的dsDNA定量造成很大影响。

同一个样本，同一瓶试剂，不同的人定量的结果都可能会出现不同程度的偏差，这跟我们的实验习惯是有很大关系的。