网站首页
走进凡知
产品中心
人才招聘
服务中心
联系我们

【Q&A】土壤与粪便样本：为什么DNA提取如此困难？

网站首页 ꄲ 新闻资讯 ꄲ 市场动态 ꄲ 【Q&A】土壤与粪便样本：为什么DNA提取如此困难？

在环境微生物组的研究中，我们往往需要提取粪便或土壤样本中的核酸做分析。但是粪便或土壤样本组分包含复杂的无机物、有机物及微生物。除了成分复杂外，粪便或土壤中的腐殖质还会抑制PCR扩增反应，以及限制性酶切，对后续的实验造成影响。因此，从粪便或土壤中提取核酸相比于从组织、细胞中提取更加复杂。

在实验时，总会遇到以下这些情况：

● 提取的DNA得率低。
● 提取的核酸出现降解，跑胶有弥散现象。

● 提取DNA的纯度过低，残留抑制物影响下游实验。

为什么土壤和粪便样本

DNA提取如此困难

土壤和粪便样本的DNA提取之所以困难，主要由于以下多方面的复杂因素：

01.样本复杂性高

基质干扰物质多：粪便和土壤中含有大量抑制物，如腐殖酸、多酚、多糖、脂类、金属离子等，这些物质会干扰酶反应（如PCR），降低提取效率。

异源性：样本中可能混合宿主DNA(如人类或动物细胞)、微生物DNA(细菌、病毒等)以及环境DNA(植物残骸、寄生虫等)，宿主DNA与微生物DNA共存时可能因理化性质差异(如片段长度、GC含量)影响提取效率。比如通常情况下提取粪便或土壤中的微生物DNA，用来分析微生物菌群之间的相互关系，样本中的宿主DNA(如肠道上皮细胞DNA)占比通常较高，导致测序数据中微生物序列比例显著降低。

02.细胞壁结构差异

微生物多样性：样本中的微生物（如革兰氏阳性菌、真菌、孢子）具有不同细胞壁结构（如肽聚糖、几丁质），需要差异化裂解方法（如机械破碎、酶处理或化学裂解）。

难破壁微生物：某些微生物（如厚壁孢子或分枝杆菌）对常规裂解方法（如溶菌酶）不敏感，导致DNA释放不完全。

03.DNA降解风险

环境核酸酶：土壤和粪便中含有大量核酸酶（如DNase），可能在样本采集前就已降解DNA。

物理化学因素：环境pH、温度、湿度或氧化应激（如活性氧）会加速DNA断裂，尤其是游离的胞外DNA。

常见问题及解决方案

问题 01

遇到难裂解的土壤样本

土壤中的革兰氏阳性菌以及真菌等因为其细胞壁比较厚，都属于比较难裂解的微生物。另外一些比较特殊的土壤样本，如沙土，其中的菌结构更为复杂，更难裂解。

凡知支招

使用磁珠法核酸提取试剂，产品中含有的研磨珠可以有效针对不同类型的微生物，尤其是对革兰氏阳性菌和真菌都能做到有效破碎，尽可能多的获得土壤中的微生物信息。

问题 02

粪便样本杂质多怎么办？

凡知支招

由于粪便样本中可能含有多种可溶性杂质，如胆红素、胆汁盐、腐殖酸、植物源性多糖等。对于成分复杂的粪便样本，倘若不进行预洗，这些杂质会在细胞及菌体裂解后，混合在释放的核酸中，并与核酸竞争结合磁珠，杂质与磁珠结合后，在洗脱时与磁珠分离，导致洗脱的DNA有颜色，纯度低。

问题 03

DNA产量低怎么办？

凡知支招

样本微生物含量低：

[1]增加样本量；

[2]进行有效的前处理过程，将杂质提前进行清除。

裂解不充分：增加物理破碎的时间和次数。
乙醇：检查洗涤液中是否加入乙醇。
洗脱不充分：建议二次洗脱增加产量或提高洗脱体积。

问题 04

提取的DNA无法扩增怎么办？

凡知支招

检测DNA的浓度：DNA浓度太低。
样本DNA稀释之后可以扩增：样本中的腐殖酸等抑制物含量高。
确定PCR反应条件是否已优化：退火温度、时间、引物等等。
非特异条带：洗脱液中目的DNA的丰度可能比较低。如果样品中的目的微生物含有比较厚的细胞壁，可能需要额外的破碎裂解。

问题 05

洗脱的DNA颜色为黄色或棕色怎么办？

凡知支招

洗脱的DNA颜色为黄色或棕色，通常是由于腐殖酸含量高导致的，以下是一些解决办法：

在洗涤步骤之前，用异硫氰酸胍溶液洗涤：使用4.5M-5.5M的异硫氰酸胍溶液洗涤1-2次，有助于去除腐殖酸等杂质，从而改善DNA的颜色。
减少样本用量：如果样本中腐殖酸等杂质含量较高，适当减少样本用量，可以降低杂质的相对含量，使洗脱的DNA颜色更接近正常。

问题 06

A260/A280比值偏低怎么办？

凡知支招

蛋白去除不干净：增加蛋白沉淀离心的次数。
洗涤不干净：增加洗涤次数。

问题 07

A260/A280比值高怎么办？

凡知支招

RNA含量高：可在洗脱之后的溶液中加入RNase消化。

问题 08

A260/A230比值低怎么办？

凡知支招

A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230高表示样品中存在一些污染物。

蛋白去除不干净：增加蛋白沉淀离心的次数。
杂质去除不干净：在核酸洗脱时，使用高质量的洗脱液，如无核酸酶的水或低盐缓冲液。确保洗脱液的体积和温度合适，以提高核酸的洗脱效率，减少杂质残留。

问题 09

提取的DNA出现降解怎么办？

凡知支招

优化裂解条件：避免过度裂解，降低物理破碎的力度。
DNase污染：操作过程中是否有污染DNase，造成DNA降解。
样品用量太多：杂质和腐殖酸含量过高的样品，可使得当降低样品的用量。
样品中含有二价金属离子：可在裂解液中加入EDTA。

问题 10

残留抑制物影响下游实验怎么办？

凡知支招

‌增加样本量‌：如果样本微生物含量低，可以增加样本量。
优化裂解条件‌：确保裂解充分，避免过度裂解，降低物理破碎的力度。如果提取的DNA出现降解，可能是裂解条件不当或操作过程中有污染，可以加入RNase I 来去除RNA污染‌。
选择合适的去杂剂‌：对于含有高有机质的样本，选择具有去除蛋白、腐殖酸等复杂抑制物的去杂剂；如果乙醇等没有充分挥发，需要充分晾晒使醇类充分挥发‌。
使用高效的提取试剂盒‌：使用高性能的提取试剂盒，如凡知医学土壤DNA提取试剂盒和粪便DNA提取试剂盒，可以有效去除样本中的腐殖酸、重金属离子等杂质‌，高效获得高纯度的DNA。